中心法則?是?分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論之一，它描述了?遺傳信息在生物體內(nèi)的傳遞和表達(dá)過程。根據(jù)這一法則，遺傳信息的傳遞一直遵循著DNA→RNA→蛋白質(zhì)這個線性框架；此后，病毒中逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)補充了中心法則，證明生物體內(nèi)也能實現(xiàn)RNA→DNA的逆向流動。

而今，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種顛覆式的現(xiàn)象：細(xì)菌的一種逆轉(zhuǎn)錄酶可以利用非編碼RNA創(chuàng)造出全新的編碼DNA。這項研究揭示了生物體遺傳信息傳遞的多樣性，強調(diào)了基因組非編碼基因的編碼潛力，打破了傳統(tǒng)法則中只能沿基因組DNA線性方向編碼遺傳信息的范式。

近日，哥倫比亞大學(xué)的科學(xué)家Stephen Tang和Samuel H. Sternberg團(tuán)隊在 Science 上發(fā)表了題為“De novo gene synthesis by an antiviral reverse transcriptase”的最新成果，研究以肺炎克雷伯菌為研究對象，揭示了一種由DRT2（defense-associated reverse transcriptase 2）防御系統(tǒng)介導(dǎo)的抗病毒防御機制。

防御相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶（Defense-associated Reverse Transcriptase, DRT）是細(xì)菌中除RT-Cas1和retron外的第三類具有抗噬菌體功能的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，被劃分為9個亞組（DRT1-9）。DRT系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)錄元件具有單基因操縱子的特征，這意味DRT系統(tǒng)可能僅依靠逆轉(zhuǎn)錄功能實現(xiàn)了噬菌體防御。但在此之前DRT系統(tǒng)中cDNA產(chǎn)物功能及免疫機制都是未知的。

該研究聚焦于肺炎克雷伯菌的DRT2系統(tǒng)（KpnDRT），因為該亞族系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，僅由單個編碼逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase，RT）的開放閱讀框（ORF）及其上游的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）構(gòu)成，后者此前未發(fā)現(xiàn)具有確切功能。與其它DRT系統(tǒng)或retron系統(tǒng)不同，DRT2系統(tǒng)缺乏額外的蛋白質(zhì)編碼基因，并且RT僅具有RNA導(dǎo)向DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)域，也沒有預(yù)測到除此以外的其它功能結(jié)構(gòu)域。因此研究人員提出1個假設(shè)：逆轉(zhuǎn)錄酶合成的cDNA產(chǎn)物可能在DRT2免疫機制中起著關(guān)鍵、核心作用。

DRT2系統(tǒng)中ncRNA鏈的堿基之間互補配對，折疊形成一個具有很多保守莖環(huán)（stem-loop，SL）的二級結(jié)構(gòu)，其中由SL2短莖連接的、具有較大3’區(qū)域的RNA區(qū)域是RT合成cDNA的模板。RT以SL2相鄰區(qū)域的UCU作為起始位點，沿著模板區(qū)域3’→5’方向移動?；氐絊L2區(qū)域時，RT“躍過”SL2環(huán)狀結(jié)構(gòu)再次移動到起始位點UCU，繼續(xù)進(jìn)行下一輪的逆轉(zhuǎn)錄。這種獨特的機制導(dǎo)致了cDNA片段不斷串聯(lián)累加，形成了串聯(lián)多個重復(fù)序列的cDNA，最長可達(dá)到40個重復(fù)。研究者將這一現(xiàn)象稱為滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄（rolling-circle reverse transcription，RCRT），類似于DNA的滾環(huán)復(fù)制。

有趣的是，細(xì)菌被T5噬菌體感染后，體內(nèi)除了ncRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA外，還會出現(xiàn)大量與ncRNA鏈性相反、包含多個重復(fù)的RNA序列，可達(dá)到未感染細(xì)菌的~10000倍。隨后實驗結(jié)果也表明合成的cDNA互補鏈可能是RNA聚合酶另一輪轉(zhuǎn)錄的模板鏈，所得轉(zhuǎn)錄本將具有與初始ncRNA相反的鏈性，并可以包含不同數(shù)量的cDNA重復(fù)序列。那么串聯(lián)的重復(fù)cDNA轉(zhuǎn)錄形成的RNA在抗噬菌體免疫反應(yīng)中又有著怎樣的作用呢？利用算法預(yù)測，單個cDNA具有一種沒有任何終止密碼子的ORF區(qū)域。RCRT在每次“跳躍”時會增加1個額外堿基，產(chǎn)生了1個120bp的cDNA重復(fù)單元，該重復(fù)單元恰好包含40個正義密碼子。這種重復(fù)單元確保了每次串聯(lián)復(fù)制中ORF的完整性，并產(chǎn)生了連續(xù)的ORF。令人驚奇的是，一個cDNA重復(fù)單元的末端與下一個cDNA重復(fù)單元的起始端形成了1個全新的啟動子，具有典型的-10和-35區(qū)域。至此，這些基于RCRT機制產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)cDNA形成了1個全新的編碼基因，并且ORF內(nèi)沒有任何終止密碼子，研究者們將其命名為Neo（never-ending ORF）。

進(jìn)一步的蛋白表達(dá)實驗證實，當(dāng)串聯(lián)的cDNA重復(fù)數(shù)等于或大于3時，neo基因編碼的蛋白質(zhì)會誘導(dǎo)宿主細(xì)胞通過關(guān)閉代謝過程來阻止噬菌體復(fù)制，并進(jìn)入程序性休眠，從而中斷病毒的傳播過程。根據(jù)KpnDRT2產(chǎn)生Neo蛋白的機制信息，研究者們進(jìn)一步在DRT2同源物中分析這種免疫機制內(nèi)部基因合成策略的進(jìn)化保守程度。分析確認(rèn)了絕大多數(shù)物種都具有與KpnDRT2相關(guān)的ncRNA和Neo蛋白，結(jié)果表明這種獨特防御機制具有廣泛的保守性。值得注意的是，對于Neo蛋白合成和表達(dá)至關(guān)重要的序列，如“跳躍”過程中的ACA-1、ACA-2以及串聯(lián)重復(fù)中的啟動子元件，在其它的同源物中也具有極高保守性。

該研究揭示了KpnDRT2防御系統(tǒng)介導(dǎo)的一種前所未有的抗病毒免疫機制。在未感染時，細(xì)菌KpnDRT2防御系統(tǒng)中的ncRNA和RT由單個啟動子組成型表達(dá)，通過介導(dǎo)RCRT過程精準(zhǔn)、程序化“跳躍”合成具有異質(zhì)性大小的、重復(fù)的單鏈cDNA。噬菌體感染后，cDNA第2鏈合成被觸發(fā)，從而導(dǎo)致串聯(lián)重復(fù)的雙鏈cDNA大量積累。隨后，相鄰cDNA連接處新形成的啟動子招募RNA聚合酶，大量表達(dá)異質(zhì)性大小的mRNA，這些mRNA可以編碼一類無終止密碼子、永無止境的ORF（neo）。進(jìn)一步地，Neo蛋白通過阻止細(xì)胞生長和誘導(dǎo)程序性休眠來保護(hù)細(xì)菌種群免受噬菌體的傳播和侵染。

這項研究闡述了一種新穎的基于DRT2系統(tǒng)的抗病毒免疫機制，這種機制證明了遺傳信息DNA和RNA兩種載體之間遺傳信息傳遞的復(fù)雜性，拓展了我們對中心法則的認(rèn)知。同時，Neo蛋白的發(fā)現(xiàn)打破了蛋白編碼基因定義的傳統(tǒng)特征，也引發(fā)我們對基因組組成的更廣泛思考。以人類基因組為例，僅有~1.5%的基因組序列被認(rèn)為是蛋白質(zhì)編碼基因，那么剩余的98.5%基因組序列是否還有更多類似于Neo蛋白的非典型蛋白質(zhì)編碼基因？我們覺得答案是肯定的。多久后能夠出現(xiàn)基于DRT系統(tǒng)的新基因工具，又是否能夠像CRISPR/Cas系統(tǒng)一樣給生物學(xué)帶來巨大的變革，令人期待。

關(guān)于我們

泓迅生物致力于成為合成生物學(xué)賦能技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者！領(lǐng)先的設(shè)計和先進(jìn)的制造工藝為全球研究人員、科學(xué)家、合成生物學(xué)家和藥物開發(fā)者提供DNA“設(shè)計—構(gòu)建—測試—學(xué)習(xí)”一體化解決方案。

l 核酸合成平臺