引物長(zhǎng)度：

引物長(zhǎng)度通常在15～30bp之間，常用的為18～27bp。

不建議引物長(zhǎng)度大于38bp，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的引物可能導(dǎo)致與模板DNA的結(jié)合能力下降，并且最適延伸溫度可能超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃），從而影響產(chǎn)物的特異性。

GC含量：

G+C含量應(yīng)在40%～60%之間，以45%～55%為宜。

上下游引物的GC含量應(yīng)保持接近，以確保Tm值（熔解溫度）相近，使得復(fù)性條件最佳。

Tm值：

引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值應(yīng)在72℃左右，這有助于優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。

避免自身互補(bǔ)：

引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)避免含有自身互補(bǔ)的堿基序列，以防止引物之間形成二聚體，影響PCR擴(kuò)增效率。

避免特定結(jié)構(gòu)：

引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量避免出現(xiàn)二硫鍵或普魯文結(jié)構(gòu)（如三個(gè)或四個(gè)相鄰的G或C堿基），這些結(jié)構(gòu)可能影響引物的穩(wěn)定性和PCR擴(kuò)增效率。

修飾：

在引物的3'端末端，可以引入一些修飾，如磷酸化或5-末端的過(guò)氧化磷酸，以提高合成效率和PCR反應(yīng)的特異性。