1、利用RNP下的雙sgRNA編輯法,實現(xiàn)基因DNA水平片段敲除
案例:對X細胞的A基因進行Exon1-13的片段敲除(KO)
(1)在需求敲除片段兩端分別設計1條高靶向的sgRNA序列,如下圖:
(2)將gRNA-A1、gRNA-A2進行化學修飾合成后分別與Cas9蛋白組裝成RNP,轉(zhuǎn)染至X細胞進行A基因片段序列敲除;
(3)敲除結(jié)果檢測如下:
DNA水平-Sanger測序顯示,A基因序列已被敲除,結(jié)果如下:
細胞表型檢測如下圖:A為正常細胞,B為A基因敲除后的突變細胞形態(tài),表明A基因被敲除。
2、RNP敲除效率遠超傳統(tǒng)質(zhì)粒法
案例:以AAVS1位點敲除為例,比較質(zhì)粒(DNA)與RNP的敲除效率
(1)將AAVS1-sgRNA1序列構(gòu)建帶有Cas9的載體中,轉(zhuǎn)染細胞后提取基因組DNA,以基因組DNA為樣本進行Sanger測序并結(jié)合Synthego ICE分析軟件檢測,結(jié)果顯示敲除率為14%;
(2)將AAVS1-sgRNA1 RNP復合物轉(zhuǎn)染細胞后進行如(1)所述檢測,結(jié)果顯示敲除效率為69%;
(3)敲除效率比較(如下圖),結(jié)果顯示RNP敲除效率是質(zhì)粒法的4-5倍,顯著高于質(zhì)粒法。