泓迅生物精心編制的載體指南,不僅內(nèi)容詳盡,而且結(jié)構(gòu)清晰,旨在為科研工作者提供一個(gè)便捷的參考工具。在載體指南中,我們?cè)敿?xì)介紹多種類型的載體,包括但不限于質(zhì)粒載體、病毒載體、克隆載體、表達(dá)載體等。我們針對(duì)每一種載體都進(jìn)行詳盡的闡述,包括其特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)、限制、應(yīng)用等關(guān)鍵信息。
泓迅生物的載體指南是一份寶貴的學(xué)習(xí)資料,它將為您在科研道路上提供有力的支持和幫助。我們期待與您攜手共進(jìn),共同推動(dòng)生物技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新。
一、載體概述
載體
將目的基因(DNA片段)轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞、組織或生物體中以實(shí)現(xiàn)基因克隆、表達(dá)、編輯等一系列功能研究,該方法是生物領(lǐng)域最常用的一種研究方法。在基因工程領(lǐng)域,為避免目的基因DNA片段序列的降解同時(shí)保證功能有效性,在轉(zhuǎn)入細(xì)胞、組織或生物體之前,需要先通過基因工程技術(shù)將目的基因構(gòu)建在一類具有在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制能力的DNA分子上,該類運(yùn)輸工具被稱為載體(Vector)。其中,工程化的質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體。
質(zhì)粒載體
質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子,常見于原核細(xì)菌及真菌中。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的,少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu),具有分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少等特點(diǎn)。通過對(duì)天然質(zhì)粒進(jìn)行元件添加、優(yōu)化等工程化改造,將其轉(zhuǎn)換成基因工程中最常用的載體,也稱為質(zhì)粒載體。
功能特點(diǎn):
? 載裝能力:具有外源基因插入位點(diǎn),外源基因插入該位點(diǎn)后不會(huì)破壞質(zhì)粒載體的功能。
? 運(yùn)輸能力:將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
? 復(fù)制或整合能力:為目標(biāo)基因提供復(fù)制能力或整合能力。
? 具有擴(kuò)增或表達(dá)能力:為目標(biāo)基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要條件。
? 具有篩選標(biāo)記。
? 具有不相容性:含有相同Ori的2個(gè)不同的質(zhì)粒不能同時(shí)存在于1個(gè)細(xì)胞中。
基本組成元件:
?。?)
復(fù)制起始點(diǎn)(Ori):一段富含AT和重復(fù)序列的特定序列,通過招募復(fù)制相關(guān)蛋白啟動(dòng)質(zhì)粒復(fù)制。Ori決定了質(zhì)粒在宿主中的拷貝數(shù),高拷貝質(zhì)粒(10-60個(gè)拷貝)被稱為松弛型復(fù)制質(zhì)粒;低拷貝質(zhì)粒(1-3個(gè)拷貝)被稱為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒,通常適用于毒性基因及大片段基因的克隆。只有1個(gè)Ori,表示是原核的克隆或表達(dá)質(zhì)粒;有2個(gè)Ori,則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒,即可在原核也可在真核中復(fù)制。注意:具有相同的ori的質(zhì)粒具有不相容性,不可共轉(zhuǎn)染。
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抗性篩選基因(R):即抗生素抗性基因,方便后續(xù)通過抗生素篩選陽性克隆。一般克隆發(fā)載體只有1種抗性篩選標(biāo)記,部分穿梭質(zhì)粒具有2種抗性篩選標(biāo)記。注意:原核生物和真核生物中的篩選基因不完全一致,原核生物中常見的有Ampr、Camr、Kanr、Tetr等;真核生物中常見的有Puro、G418、Hygr;原核和真核都可以的篩選基因有Zeocin、Blasticidin。
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多克隆位點(diǎn)(MCS):即多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)匯集序列區(qū),其中的每個(gè)酶切位點(diǎn)在整個(gè)質(zhì)粒載體中只有一個(gè)。MCS區(qū)是外源基因的插入位點(diǎn),一般位于啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)元件之間。不同載體,MCS所包含的限制性內(nèi)切酶種類、數(shù)目不同。注意:插入基因序列過長會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化效率變低。
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啟動(dòng)子(P):通過與RNApol特異型結(jié)合,啟動(dòng)下游DNA轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列,本身不被轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子決定基因表達(dá)的細(xì)胞類型及表達(dá)量。根據(jù)在細(xì)胞中啟動(dòng)表達(dá)的形式不同,分為3類:組成型/廣譜型啟動(dòng)子,組織/細(xì)胞基因特異性啟動(dòng)子,誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子。
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增強(qiáng)子(Enhancer):一種增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的順式作用元件,無方向性。
(6)
核糖體識(shí)別位點(diǎn)(RBS):位于mRNA的起始密碼子(AUG)上游,核糖體可以識(shí)別、結(jié)合這段序列并向下尋找ATG以起始蛋白翻譯。在原核生物中表達(dá)載體上的RBS為SD序列(位于AUG前面);在真核生物中,主要依賴于mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu),除此之外,IRES元件和2A多肽元件也可作為RBS以啟動(dòng)蛋白表達(dá)。
(7)
轉(zhuǎn)錄終止子(Terminator):位于待轉(zhuǎn)錄基因下游的3’端調(diào)控元件之后,主要為多聚腺苷酸化或聚(A)信號(hào),具有終止轉(zhuǎn)錄功能。原核生物主要為polyA;真核生物如哺乳動(dòng)物常見的終止子(SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA和rbGlob)包括促進(jìn)聚腺苷酸化和終止的序列基序AAUAAA。
?。?)引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS):一段短的單鏈DNA序列,可以與PCR擴(kuò)增或測(cè)序的引物結(jié)合,主要用于質(zhì)粒序列的人工檢測(cè)。注意:該類位點(diǎn)可以根據(jù)應(yīng)用進(jìn)行靈活設(shè)計(jì)。
二、質(zhì)粒載體分類
質(zhì)粒載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因功能表達(dá),這些載體在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,是推動(dòng)合成生物學(xué)、生物醫(yī)藥、基因治療、靶點(diǎn)藥物篩選及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)展的基礎(chǔ)。根據(jù)質(zhì)粒載體的多樣化應(yīng)用,其分類也是多樣化的,主要有以下幾種:
1、按照屬性質(zhì)粒載體可分為:病毒載體和非病毒載體。其中,病毒載體是一種利用病毒作為基因傳遞的載體,通常通過將外源基因插入或替換病毒基因組的方式,將所需的基因輸送至目標(biāo)細(xì)胞中。病毒載體具有高度傳染性和特異性,能夠在宿主細(xì)胞中高效地傳遞和表達(dá)外源基因。
病毒載體的應(yīng)用:
?。?)基因治療:利用病毒載體將治療性基因?qū)氲侥繕?biāo)細(xì)胞中,用于治療遺傳性疾病、癌癥等疾病。
?。?)基因編輯:利用病毒載體將基因編輯工具(如CRISPR/Cas9系統(tǒng))輸送至目標(biāo)細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)基因組的精準(zhǔn)編輯和修飾。
?。?)疫苗開發(fā):利用病毒載體作為疫苗遞送平臺(tái),輸送目標(biāo)抗原基因至免疫細(xì)胞中,誘導(dǎo)免疫反應(yīng),從而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
?。?)基因研究:在基因功能研究、蛋白質(zhì)表達(dá)和藥物篩選等領(lǐng)域,病毒載體用于將特定基因傳遞到細(xì)胞或動(dòng)物模型中,研究其功能和作用機(jī)制。
病毒載體分類及比較如下:
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載體類型
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定義
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特點(diǎn)
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優(yōu)勢(shì)
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限制
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慢病毒(LV)載體
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一種基于慢病毒(如人類免疫缺陷病毒HIV-1)的基因傳遞系統(tǒng),去除了病毒的復(fù)制和致病基因,慢病毒載體保留了病毒將遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中特性。
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1、整合能力:可將外源基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體DNA中。
2、宿主范圍廣:對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都有感染能力。
3、可穩(wěn)定性表達(dá)。
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載荷容量較大:適用于攜帶較大基因片段或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
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潛在致癌風(fēng)險(xiǎn):基因整合可能導(dǎo)致插入突變,增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。
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腺病毒載體
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一種基于腺病毒(Adenovirus)的基因轉(zhuǎn)移工具,腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒,能夠在非分裂的細(xì)胞中高效地表達(dá)外源基因,不整合到宿主細(xì)胞基因組中,適合短期表達(dá)。
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1、非整合能力。
2、感染范圍廣:能夠感染包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞在內(nèi)的廣泛宿主細(xì)胞。
3、瞬時(shí)表達(dá)。
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1、高效感染:能夠在短時(shí)間內(nèi)感染大量細(xì)胞。
2、安全性高:腺病毒載體不整合到宿主細(xì)胞染色體中,無插入致突變性。
3、高滴度:腺病毒載體可產(chǎn)生高滴度的病毒液,有利于大規(guī)模制備和應(yīng)用。
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1、瞬時(shí)表達(dá):外源基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短,需要多次接種以達(dá)到治療效果。
2、免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn):腺病毒具有較強(qiáng)的免疫原性,可能引發(fā)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng),影響治療效果。
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腺相關(guān)病毒(AAV)載體
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一種基于腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)的基因轉(zhuǎn)移工具,AAV是一種小的、非包膜的單鏈DNA病毒,它與多種腺病毒有關(guān),但與腺病毒不同,AAV本身不會(huì)引起疾病,因此在作為基因載體時(shí)具有很高的安全性。
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1、小型單鏈DNA病毒:基因組DNA<5 kb,無包膜。
2、非致病性:AAV自然存在于人類中,但并不會(huì)導(dǎo)致任何已知的疾病。
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1、安全性高:AAV不會(huì)破壞宿主細(xì)胞的基因組,不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)或病理反應(yīng)。
2、可長期表達(dá):AAV可以在宿主細(xì)胞中長期表達(dá)外源基因。
3、靶向性:AAV有多種血清型,不同的AAV血清型可以靶向不同的細(xì)胞和組織。
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1、載體容量有限:AAV的基因組較小,能夠攜帶的外源基因序列長度有限,通常不超過4.5 kb。
2、免疫原性:雖然AAV的免疫原性較低,但在部分人群中仍可能引起免疫反應(yīng)。
3、制備成本高:AAV的制備過程較為復(fù)雜,成本較高。
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逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
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一種利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為遞送系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移工具,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常來源于能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的病毒,如人類免疫缺陷病毒(HIV)經(jīng)過改造后的形式。
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1、RNA病毒:逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒,其基因組以RNA形式存在。
2、逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制:逆轉(zhuǎn)錄病毒利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為DNA,并整合到宿主細(xì)胞基因組中。
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1、穩(wěn)定表達(dá):由于整合到宿主基因組,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以實(shí)現(xiàn)長期的基因表達(dá)。
2、較大基因載量:逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠攜帶較大的外源基因序列,通??蛇_(dá)8-10 kb。
3、感染效率高:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以感染多種類型的細(xì)胞,包括一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型。
4、技術(shù)成熟:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)相對(duì)成熟,有多種載體和包裝系統(tǒng)可供選擇。
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1、整合位點(diǎn)不確定性:逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)整合到宿主基因組中,可能引起插入突變,導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。
2、主要感染分裂細(xì)胞。
3、潛在的免疫反應(yīng):盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒通常不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),但在某些情況下仍可能引發(fā)宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。
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2、按照進(jìn)入受體細(xì)胞的類型不同可分為原核載體、真核載體和穿梭載體(即可以存在于原核細(xì)胞,又可存在于真核細(xì)胞)。
3、按照Ori元件不同可分為高拷貝質(zhì)粒和低拷貝質(zhì)粒。
4、按照載體性質(zhì)不同可分為融合型載體和非融合型載體。融合型載體能夠?qū)⑼庠椿蛘线M(jìn)宿主細(xì)胞的基因組實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá),又稱為穩(wěn)定型表達(dá)載體;非融合型載體裝載著目標(biāo)基因以游離的形式存在于細(xì)胞中,使得目標(biāo)基因在宿主細(xì)胞中的短暫表達(dá),又稱為瞬時(shí)表達(dá)載體。
瞬時(shí)表達(dá)載體與穩(wěn)定性表達(dá)載體比較如下:
質(zhì)粒類型
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工作原理
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導(dǎo)入細(xì)胞方法
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特點(diǎn)
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優(yōu)勢(shì)
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限制
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應(yīng)用
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瞬時(shí)表達(dá)載體
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游離于細(xì)胞中,帶動(dòng)目標(biāo)基因在短時(shí)間內(nèi)快速表達(dá)并達(dá)到高峰,隨后逐漸降低。
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病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等。
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篩選標(biāo)記基因是非必須元件;
表達(dá)快速、操作簡(jiǎn)單。
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表達(dá)快速、操作簡(jiǎn)單、靈活、成本低
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1、可能觸發(fā)細(xì)胞防御機(jī)制,導(dǎo)致基因沉默;
2、高效表達(dá)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性;
3、表達(dá)非永久且不穩(wěn)定。
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快速分析基因的功能或蛋白活性。
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穩(wěn)定表達(dá)載體
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將目標(biāo)基因整合在宿主細(xì)胞基因組后使得目標(biāo)基因持續(xù)且穩(wěn)定性表達(dá)。
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病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等
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篩選標(biāo)記基因是必須元件;
持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)
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長期穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)水平可控、遺傳穩(wěn)定性、安全性高、可重復(fù)性好
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1、轉(zhuǎn)化效率低;
2、細(xì)胞篩選周期長、成本高;
3、轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化條件苛刻
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在基因工程、細(xì)胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,如重組蛋白生產(chǎn)、基因功能研究、基因治療藥物開發(fā)等。
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5、按照功能不同可分為克隆載體、表達(dá)載體、基因編輯載體、表達(dá)調(diào)控載體、體外轉(zhuǎn)錄載體及功能檢測(cè)載體等。
? 克隆載體查看詳細(xì)
主要元件組成:復(fù)制起始點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)及抗性篩選基因。
主要功能與應(yīng)用:用于DNA復(fù)制與擴(kuò)增。
? 表達(dá)載體查看詳細(xì)
主要元件組成:除了克隆載體的基本元件,還須具備轉(zhuǎn)錄/翻譯所必須的DNA元件,如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄生成RNA,合成的RNA在轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)下停止轉(zhuǎn)錄。
(1)根據(jù)啟動(dòng)子類型可分為組成型表達(dá)載體、組織特異性表達(dá)載體和誘導(dǎo)表達(dá)載體,比較如下:
載體類型
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特點(diǎn)
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優(yōu)勢(shì)
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限制
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應(yīng)用
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組成型表達(dá)載體
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能在多種細(xì)胞類型或生物體中實(shí)現(xiàn)基因的持續(xù)表達(dá)。
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表達(dá)量高;
構(gòu)建及使用較為簡(jiǎn)單;
通用性:不受細(xì)胞類型限制
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缺乏調(diào)控性:基因過表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性;
持續(xù)表達(dá),消耗過量細(xì)胞資源,影響細(xì)胞的正常生理功能。
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通過基因亞細(xì)胞定位及過表達(dá)研究基因功能;
提高基因表達(dá)量以獲得大量目標(biāo)蛋白
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組織特異性表達(dá)載體
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在特定的細(xì)胞類型、發(fā)育階段或環(huán)境條件下,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇性表達(dá)。
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特異性表達(dá):能夠在特定的細(xì)胞類型、組織類型下實(shí)現(xiàn)外源基因的特異性表達(dá),而不影響其他細(xì)胞或組織。
特定調(diào)控元件:如組織特異性啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)子或響應(yīng)元件等,用于調(diào)控外源基因的表達(dá)。
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復(fù)雜性:需要設(shè)計(jì)和構(gòu)建特異性調(diào)控元件,相對(duì)比較復(fù)雜,需要一定的技術(shù)和資源支持。
表達(dá)水平波動(dòng):外源基因的表達(dá)水平可能不夠穩(wěn)定,需要進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)控元件以提高表達(dá)的穩(wěn)定性。
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適用于多種研究或應(yīng)用領(lǐng)域,如基因治療、基因調(diào)控、生物傳感等。
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誘導(dǎo)表達(dá)載體
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含有特定的誘導(dǎo)或響應(yīng)元件,在特定的外部信號(hào)或誘導(dǎo)劑的作用下,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控性表達(dá)。
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精確調(diào)控:可精確控制基因表達(dá)的時(shí)間和強(qiáng)度,有助于避免非特異性效應(yīng)。
節(jié)省成本:只在必要時(shí)誘導(dǎo)表達(dá),避免了持續(xù)表達(dá)可能造成的資源浪費(fèi)。
靈活性高:能夠根據(jù)需要選擇不同的誘導(dǎo)條件,實(shí)現(xiàn)外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)或抑制。
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操作復(fù)雜:需要精確控制誘導(dǎo)劑的添加時(shí)間和濃度,以及可能需要考慮誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的影響。
誘導(dǎo)條件限制:誘導(dǎo)型表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)通常受到特定條件的限制,可能不適用于所有研究或應(yīng)用場(chǎng)景。
表達(dá)水平波動(dòng):不同實(shí)驗(yàn)條件下,表達(dá)水平可能存在波動(dòng),需要精細(xì)調(diào)控。
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適用于特定條件下基因功能研究及蛋白的表達(dá)。
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(2)根據(jù)啟動(dòng)子來源可分為哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、大腸桿菌表達(dá)載體等。
(3)根據(jù)目標(biāo)基因類型可分為常規(guī)基因表達(dá)載體、重組蛋白表達(dá)載體、非編碼RNA表達(dá)載體、抗體蛋白表達(dá)載體等。
常規(guī)基因表達(dá)載體、重組蛋白表達(dá)載體、非編碼RNA表達(dá)載體及抗體蛋白表達(dá)載體比較如下:
載體類型
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目標(biāo)基因
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特點(diǎn)
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限制
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應(yīng)用
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常規(guī)基因表達(dá)載體
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未知功能的基因或特定序列
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具有篩選marker或報(bào)告基因元件:通過篩選marker或報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)基因的亞細(xì)胞定位或?qū)崿F(xiàn)基因過表達(dá)或恢復(fù)表達(dá)。
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免疫原性:部分表達(dá)載體會(huì)使宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng),導(dǎo)致載體被清除或細(xì)胞死亡。
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基因的功能研究
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重組蛋白表達(dá)載體
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編碼目標(biāo)蛋白的基因序列
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根據(jù)目標(biāo)蛋白設(shè)計(jì)出的基因序列,不一定是天然存在的;
含有目標(biāo)蛋白篩選、純化的特定標(biāo)簽元件;
具有多樣化的蛋白表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物、昆蟲細(xì)胞等。
啟動(dòng)子多為誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子;
具有良好的擴(kuò)展性:從實(shí)驗(yàn)級(jí)別到工業(yè)級(jí)別。
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1、成本高:從載體構(gòu)建到蛋白純化。
2、放大困難:主要受困于細(xì)胞生長條件、產(chǎn)物穩(wěn)定性維持等。
3、部分蛋白因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以正確折疊或易被宿主細(xì)胞降解等原因而無法高效表達(dá)。
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非編碼RNA表達(dá)載體
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miRNA、siRNA、lncRNA或circRNA等多種類型
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特異性:針對(duì)特定的基因或RNA分子進(jìn)行RNA序列選擇及設(shè)計(jì)。
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1、引發(fā)免疫反應(yīng);
2、出現(xiàn)非特異性調(diào)控;
3、穩(wěn)定性差:非編碼RNA 在體內(nèi)的穩(wěn)定性較低
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1、調(diào)控基因表達(dá);
2、可作為研究非編碼RNA生物學(xué)功能的有利工具;
3、具有治療某些由異?;虮磉_(dá)引起的疾病
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抗體蛋白表達(dá)載體
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編碼特定抗體的基因序列,包含編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA片段
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靈活性強(qiáng):可表達(dá)多種類型的抗體,包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體等。
通過改造和優(yōu)化載體,還可以實(shí)現(xiàn)多基因共表達(dá)、融合蛋白表達(dá)等高級(jí)應(yīng)用。
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1、表達(dá)效率的不穩(wěn)定性:載體表達(dá)效率受到宿主細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件、基因序列等因素導(dǎo)致表達(dá)效率的不穩(wěn)定。
2、活性不易控制:抗體聚集和錯(cuò)誤折疊而失去活性。
3、純化成本高:昂貴的純化試劑和設(shè)備,增加了抗體生產(chǎn)的成本。
4、宿主細(xì)胞的安全性:某些宿主細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)進(jìn)行抗體表達(dá)時(shí),可能攜帶病毒、細(xì)菌或其他病原體,需要嚴(yán)格的生物安全措施來確保生產(chǎn)過程中的安全。
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抗體藥物研發(fā)
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主要功能與應(yīng)用:
(1)基因表達(dá)與功能研究:在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)基因,并研究該基因在宿主細(xì)胞中的功能。這種技術(shù)對(duì)于理解基因在生物體內(nèi)的作用機(jī)制、基因功能發(fā)現(xiàn)等具有重要意義。
(2)蛋白生產(chǎn):用于生產(chǎn)具有特定功能的蛋白質(zhì)。通過選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞和表達(dá)載體,可以高效地表達(dá)并純化目標(biāo)蛋白,用于生物制藥、診斷試劑、工業(yè)酶等領(lǐng)域。
(3)基因療法:在基因治療領(lǐng)域,表達(dá)載體可將正常的基因?qū)氲交颊叩募?xì)胞中,以替換或修復(fù)缺陷基因。通過這種表達(dá)載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)基因在患者細(xì)胞中的長期、穩(wěn)定表達(dá),從而達(dá)到治療疾病的目的。
(4)疫苗開發(fā):表達(dá)載體將抗原基因?qū)胩囟ㄋ拗骷?xì)胞中表達(dá),誘發(fā)免疫反應(yīng)可以制備出具有免疫原性的抗原蛋白。這些抗原蛋白可以用于制備疫苗,預(yù)防和控制傳染病的發(fā)生。
? 編輯載體查看詳細(xì)
編輯載體(Editing Vector)是一種用于基因編輯的分子工具,它通?;谫|(zhì)粒(plasmid)或其他DNA載體系統(tǒng),并攜帶特定的基因編輯元件,如DNA核酸酶、識(shí)別序列以及模板DNA等,用于在目標(biāo)生物體的基因組中進(jìn)行精確的DNA序列修改。編輯載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建需要高度的專業(yè)知識(shí)和技能,以確保編輯的精確性和效率。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展,編輯載體在生物醫(yī)學(xué)研究、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景越來越廣闊。
主要功能與應(yīng)用:
(1)基因敲除:通過DNA核酸酶在特定位置切割DNA,然后依賴細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制(如非同源末端連接)來刪除或破壞基因。
(2)基因敲入:在DNA切割后,通過提供模板DNA來引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行同源重組,從而在特定位置插入新的DNA序列。
(3)基因修復(fù):類似于基因敲入,但用于修復(fù)已存在的突變或缺陷。
根據(jù)編輯對(duì)象不同,主要分為CRISPR Cas9敲除載體和CRISPR Cas13敲除載體,比較如下表:
載體類型
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定義
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特點(diǎn)
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編輯對(duì)象
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限制
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CRISPR Cas9敲除載體
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一種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因敲除(Knockout,Ko)工具。載體上的Cas9蛋白來源于化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR/Cas系統(tǒng),能夠精確地識(shí)別和切割目標(biāo)DNA序列,實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除。
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1、靈活性:載體構(gòu)建技術(shù)易于操作,可以通過改變Cas9蛋白的序列實(shí)現(xiàn)對(duì)不同DNA序列的剪切。
2、廣泛適用性:載體構(gòu)建技術(shù)可廣泛應(yīng)用于各種生物體系,包括細(xì)菌、酵母、植物、動(dòng)物等。
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DNA
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1、脫靶效應(yīng):存在一定的脫靶效應(yīng)。
2、基因組不穩(wěn)定性:引起的DNA斷裂和修復(fù)可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性,增加突變的風(fēng)險(xiǎn)。
3、致癌風(fēng)險(xiǎn):研究表明,CRISPR Cas9-Ko載體可能引發(fā)某些類型的癌癥。
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CRISPR Cas13敲除載體
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Cas13是一種能夠切割RNA的CRISPR相關(guān)蛋白,具有高度的RNA識(shí)別和切割能力,能夠精確地識(shí)別和切割目標(biāo)RNA序列。
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1、靈活性:Cas13-Ko載體可以靈活地針對(duì)不同的RNA序列進(jìn)行編輯,只需要更換相應(yīng)的crRNA即可。
2、安全性:Cas13-Ko載體在RNA水平下進(jìn)行編輯,不會(huì)改變基因組DNA序列,因此避免了可能由DNA編輯引起的脫靶效應(yīng)和基因突變等風(fēng)險(xiǎn)。此外,Cas13-Ko載體在編輯過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少,對(duì)細(xì)胞毒性較低,進(jìn)一步提高了其安全性。
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RNA
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1、脫靶效應(yīng):盡管CRISPR Cas13在RNA識(shí)別方面具有較高的特異性,但仍存在一定的脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。
2、長期效果和安全性:CRISPR Cas13-Ko載體在RNA編輯方面的長期效果和安全性仍需要進(jìn)一步研究和評(píng)估。
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? 表達(dá)調(diào)控載體查看詳細(xì)
表達(dá)調(diào)控載體通常包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等必須的順式調(diào)控元件,以及一個(gè)或多個(gè)用于插入目標(biāo)基因的多克隆位點(diǎn)。通過設(shè)計(jì)這些調(diào)控元件,研究人員可以精確地控制目標(biāo)基因在特定時(shí)間、特定組織或特定條件下的表達(dá)水平。
主要功能與應(yīng)用:
(1)基礎(chǔ)科學(xué)研究:通過構(gòu)建表達(dá)調(diào)控載體,可以精確地控制目標(biāo)基因在特定時(shí)間或特定細(xì)胞類型中的表達(dá),從而深入研究該基因在生物體中的功能。
(2)代謝工程:通過精確控制關(guān)鍵酶的表達(dá)水平,提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或改變其代謝產(chǎn)物的比例。
(3)醫(yī)藥研發(fā):通過調(diào)控治療基因的表達(dá)來糾正或補(bǔ)償缺陷基因的功能,實(shí)現(xiàn)疾病的基因治療。
(4)作物改良:通過提高抗旱、抗病或抗蟲基因的表達(dá)水平,增強(qiáng)作物的抗逆性。
根據(jù)調(diào)控表達(dá)形式主要分為CRISPRi載體及CRISPRa載體。詳情如下表:
載體類型
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特點(diǎn)
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關(guān)鍵元件
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工作原理
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CRISPRi載體
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用CRISPR/Cas系統(tǒng)從阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始來抑制或沉默特定基因的表達(dá);
CRISPRi介導(dǎo)的敲低是可誘導(dǎo)且可逆的。
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dCas9、sgRNA、KRAB
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主要依賴于dCas9(沒有切割活性的Cas9)和sgRNA(單鏈引導(dǎo)RNA)的復(fù)合物。當(dāng)這個(gè)復(fù)合物被引導(dǎo)到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)時(shí),dCas9能夠物理性地阻礙RNA聚合酶的通過,導(dǎo)致基因沉默。同時(shí),dCas9可以融合一個(gè)基因抑制結(jié)構(gòu)域,如KRAB結(jié)構(gòu)域,進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率。這種結(jié)構(gòu)域可以阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合,從而抑制基因的表達(dá)。
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CRISPRa載體
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利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理進(jìn)行基因激活表達(dá);
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dCas9、sgRNA、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如VP64或p65AD)
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將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如VP64或p65AD)融合,形成一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活功能的Cas9-激活域融合蛋白。當(dāng)這個(gè)融合蛋白與sgRNA結(jié)合時(shí),它可以被引導(dǎo)到目標(biāo)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)段,并通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的作用,促進(jìn)RNA聚合酶的招募和轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的激活。
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? 體外轉(zhuǎn)錄載體查看詳細(xì)
體外轉(zhuǎn)錄(In Vitro Transcription,IVT)載體,又稱為無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄載體,是一種在實(shí)驗(yàn)室條件下,利用純化的DNA作為模板,在試管或其他容器中進(jìn)行的RNA合成過程。主要用于生產(chǎn)和研究RNA分子。
主要功能與應(yīng)用:
(1)mRNA疫苗和免疫治療:通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù),可以制備出編碼特定抗原的mRNA,這些mRNA可以在體內(nèi)被細(xì)胞攝取并翻譯成蛋白質(zhì),從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這種技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種傳染病和腫瘤的疫苗研發(fā)中。
(2)基因功能研究:在分子生物學(xué)和生物技術(shù)的基礎(chǔ)研究和教學(xué)領(lǐng)域,體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是一種重要的實(shí)驗(yàn)工具。通過體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),可以幫助學(xué)生和研究人員更深入地理解RNA的合成、加工和功能機(jī)制。
(3)生物合成和代謝工程:用于生產(chǎn)具有特定功能的RNA分子,如RNA酶、RNA適配體等。這些RNA可以用于生產(chǎn)特定的生物活性物質(zhì)或調(diào)節(jié)代謝途徑。
(4)診斷與檢測(cè):還可以用于生產(chǎn)標(biāo)記有放射性同位素或其他探針的RNA分子,通過檢測(cè)特定RNA分子的表達(dá)水平或結(jié)構(gòu)變化,可以判斷疾病的發(fā)病機(jī)制和病情進(jìn)展。
根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同主要分為RNA體外轉(zhuǎn)錄載體和mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體。詳情如下表:
載體類型
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必須元件
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IVT產(chǎn)物
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RNA體外轉(zhuǎn)錄載體
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T7啟動(dòng)子
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RNA
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mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體
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T7啟動(dòng)子、Kozark序列、5’UTR、3’UTR、polyA
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mRNA
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優(yōu)勢(shì):
(1)高效快速:可以在短時(shí)間內(nèi)合成出大量的RNA/mRNA分子,滿足實(shí)驗(yàn)需求。
(2)高純度:通過體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成的RNA/mRNA分子純度高,不需要經(jīng)過復(fù)雜的分離和純化步驟。
(3)靈活性:可以合成各種長度和序列的RNA/mRNA分子,適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求。
(4)可控性強(qiáng):體外轉(zhuǎn)錄過程可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行控制,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整反應(yīng)條件和時(shí)間。
(5)適用于大規(guī)模生產(chǎn):由于體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的高效性和可控性,它適用于大規(guī)模生產(chǎn)RNA分子,如mRNA疫苗的生產(chǎn)等。
限制:
(1)穩(wěn)定性受限:體外轉(zhuǎn)錄的RNA/mRNA分子在保存和運(yùn)輸過程中可能受到溫度、濕度等環(huán)境因素的影響,導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。
(2)可能產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物:在體外轉(zhuǎn)錄過程中,可能會(huì)產(chǎn)生一些非特異性的RNA產(chǎn)物,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
(3)不適用于所有類型的RNA合成:雖然體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以合成多種類型的RNA分子,但對(duì)于某些特殊的RNA結(jié)構(gòu)或功能可能無法實(shí)現(xiàn)有效合成。
? 啟動(dòng)子功能檢測(cè)載體查看詳細(xì)
啟動(dòng)子功能檢測(cè)載體將目標(biāo)啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因(熒光蛋白、酶等)相連,并將其導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞或組織中。當(dāng)啟動(dòng)子被激活時(shí),會(huì)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá),通過觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況來評(píng)估啟動(dòng)子的活性。
關(guān)鍵元件:
一個(gè)啟動(dòng)子插入位點(diǎn)及供啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的報(bào)告基因,以及必要的調(diào)控序列和標(biāo)記基因。
特點(diǎn):
報(bào)告基因多樣:通常包含一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因,如熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP),用于衡量啟動(dòng)子的活性。
應(yīng)用優(yōu)勢(shì):
(1)快速篩選:能夠快速識(shí)別和評(píng)估啟動(dòng)子的活性。
(2)定量分析:報(bào)告基因的表達(dá)水平可以量化,便于比較不同啟動(dòng)子的效率。
(3)多樣性評(píng)估:適用于多種研究應(yīng)用,包括啟動(dòng)子鑒定、功能分析和優(yōu)化。
(4)技術(shù)成熟:利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件活性及結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路與細(xì)節(jié)已經(jīng)非常成熟。
應(yīng)用限制:
(1)背景噪聲:某些載體可能存在非特異性表達(dá),導(dǎo)致背景噪聲。
(2)宿主限制:?jiǎn)?dòng)子的活性可能受到宿主細(xì)胞類型的影響。
(3)成本:購買或構(gòu)建高特異性的檢測(cè)載體可能成本較高。
? 蛋白互作檢測(cè)載體查看詳細(xì)
蛋白互作檢測(cè)通常通過構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn),其中目標(biāo)蛋白序列與報(bào)告基因或標(biāo)簽序列融合,并在宿主細(xì)胞中共表達(dá)這兩個(gè)融合蛋白。當(dāng)這兩個(gè)融合蛋白發(fā)生相互作用時(shí),它們能夠激活或抑制與它們相連的報(bào)告基因,從而引發(fā)可測(cè)量的信號(hào)變化,如熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)或顏色的改變。通過檢測(cè)這些信號(hào)變化,研究人員能夠評(píng)估并量化蛋白質(zhì)之間的相互作用。
關(guān)鍵元件:
目標(biāo)基因插入位點(diǎn)、用于報(bào)告蛋白互作的報(bào)告系統(tǒng)元件。
特點(diǎn):
(1)雙報(bào)告基因系統(tǒng):通常包含兩個(gè)報(bào)告基因,用于監(jiān)測(cè)蛋白間的相互作用。
(2)融合標(biāo)簽:載體設(shè)計(jì)包含融合蛋白標(biāo)簽,如GST、His或Flag,便于蛋白的純化和檢測(cè)。
(3)信號(hào)放大:一些載體通過信號(hào)放大機(jī)制提高檢測(cè)的靈敏度。
優(yōu)勢(shì):
(1)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè):可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白互作的動(dòng)態(tài)過程。
(2)定量分析:提供了一種定量分析蛋白互作強(qiáng)度的方法。
(3)高通量篩選:適用于大規(guī)模篩選實(shí)驗(yàn),有助于快速識(shí)別互作蛋白。
(4)應(yīng)用廣泛:可用于藥物篩選、疾病機(jī)制研究和信號(hào)傳導(dǎo)途徑分析。
限制:
(1)假陽性/假陰性:可能由于非特異性結(jié)合或?qū)嶒?yàn)條件不當(dāng)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。
(2)局限性:蛋白互作檢測(cè)載體通常只能檢測(cè)到已知蛋白質(zhì)之間的相互作用,對(duì)于未知的蛋白質(zhì)相互作用可能無法檢測(cè)。此外,一些低親和力或瞬時(shí)的蛋白質(zhì)相互作用也可能無法被檢測(cè)到。